Structural characterisation and drug-lipid interaction by NMR spectroscopy

Abstract

<p>Since the discovery of antimicrobial agents and the extensive use in infection treatment and prevention, antimicrobial resistance (AMR) has become a rapidly increasing problem. The World health organisation (WHO) surveys a wide range of human pathogens, including several multi-resistant pathogens causing infections with high morbidity and mortality. Emphasising the urgency of new treatment strategies, is the fact that WHO estimates that by 2050, antibiotic resistance will surpass deaths due to cancer, with up to 10 million people dying each year. There is a sore need for new alternatives and strategies. One prominent alternative is antimicrobial peptides (AMPs). AMPs are an integral part of life, as hostdefence peptides, and are found in all domains of life. Bacteria have lower chance of developing resistance against AMPs, partially because of their diverse modes-of-action. This is therefore a promising strategy to prolong the potential usage of AMPs in future therapy. Since the discovery of AMPs, there has been extensive work revealing their modes-of-action and connections between structure and effect. As they are a diverse group of molecules, and their targets are even more complicated, there are still many things that are not yet fully understood. Expanding our knowledge regarding AMP-target interactions, future research can potentially resolve the emerging challenges in infection control and treatment, broadening the currently available treatment options. <p>In this dissertation for the degree of philosophiae doctor, this work focuses on both refining methodological approaches and generating a new understanding about selected AMPs. Efforts towards developing a robust platform for further investigation of AMPs looking for complementary agents to antibiotics or adjuvating strategies to aid for more effective antibiotic treatment strategies have been initiated. For that purpose, finetuned instrumental approaches are crucial for driving our research further in this field and uncovering new knowledge. <p>NMR spectroscopy is an information-rich and versatile tool, that is already widely used to investigate intricate peptide-membrane interactions. However, observations were made about possible improvements to study and develop methods to investigate the interaction between peptides and membranes, including their binding to and conformational changes in contact with lipid membranes. Self-aligning SMA-QA nanodiscs showed signs of bound peptide at even natural abundance, though isotope labelling will be necessary to properly study the peptides. As part of this effort, microscale thermophoresis was used in tandem as a lowIX threshold method to investigate peptide interactions with different membrane models. Results showed that positively charged SMA-QA nanodiscs are good membrane models for cationic AMPs, that yield results comparable to more labour-intensive methods such as surface plasmon resonance. <p>Finally, both standard NMR techniques and anisotropic NMR procedures were used to elucidate the structure of a new natural product, Commafric A, and investigate the conformational changes of five cyclic tetrapeptides with an unusual α,α‐disubstituted β2,2- amino acid depending on their primary structure, and five cyclic hexapeptides in gradually more lipophilic environments. Even with widely different antimicrobial effects, the backbone conformations did not change significantly between the peptides, indicating that antimicrobial effect is affected primarily by amino acid composition, rather than peptide conformation.

<p>Siden antimikrobielle agenter først ble oppdaget og etter lang tids overforbruk i behandling og forebygging av infeksjoner har antibiotikaresistens blitt et økende problem. Verdens helseorganisasjon (WHO) holder allerede øye med en rekke menneskelige patogener, inkludert flere multiresistente bakterier som fører til høy sykdomsfremkomst og dødelighet. Noe som understreker alvorligheten i situasjonen er det faktum at WHO estimerer at innen 2050 vil antibiotikaresistens forårsake flere årlige dødsfall enn kreft, med opptil 10 millioner mennesker som dør hvert år. Det er et sårt behov for nye alternativer og strategier. Et fremtredende alternativ er antimikrobielle peptider (AMP). AMP er allerede en viktig basis for liv, som vert-beskyttelsespeptider, og finnes i alle livets domener. Bakterier har en generelt lavere sjanse for å utvikle resistens mot AMP, delvis på grunn av hvordan peptider interagerer med bakterier. Dette er derfor en lovende strategi for å forlenge bruk av AMP i fremtidig terapi. Siden AMP først ble oppdaget har det vært gjort mye arbeid for å forstå virkemåten deres og sammensetningen mellom struktur og effekt. Da de er en sammensatt gruppe molekyler, med enda mer kompliserte biologiske mål, er det fremdeles mye som ikke er fullstendig forstått. Ved å utvide forståelsen vår rundt interaksjoner mellom AMP og biologiske mål kan fremtidig forskning løse den kommende utfordringen rundt infeksjonskontroll og behandling, og utvide de behandlingsmåtene vi har tilgjengelig i dag. <p>I denne avhandlingen for graden philosopiae doctor har arbeidet fokusert på å videreutvikle metodiske tilnærminger og frembringe en ny forståelse rundt utvalgte AMP. Dette er en del av en pågående innsats for å utvikle en plattform som kan bli brukt i videre arbeid mot å finne komplementære agenter til antibiotika eller subsidierende strategier som kan brukes til mer effektive antimikrobielle behandlingsstrategier. For det formålet er fininnstilte instrumentelle tilnærmelser uhyre viktig for å drive forskning videre i dette feltet og avdekke ny viten. <p>NMR spektroskopi er et mangfoldig verktøy som gir mye informasjon og som allerede er brukt til mange formål for å utforske intrikate interaksjoner mellom peptider og membraner. Observasjoner ble gjort om mulige forbedringer for å studere og videreutvikle metoder til å etterforske disse interaksjonene mellom peptider og membraner, inkludert binding og konformasjonelle endringer i kontakt med lipidmembraner. SMA-QA nanodisker som retter seg inn av seg selv i magnetiske felt viste spor av bundet peptid selv ved naturlig isotopmengde, men isotopmerking er nødvendig for å kunne studere peptidene fullstendig. Som en del av dette arbeidet ble mikroskala termodiffusjon brukt i tandem som en lavterskel teknikk til å undersøke interaksjonen mellom peptider og ulike membranmodeller. Resultatene viste at de positivt ladede SMA-QA nanodiskene er gode membranmodeller for kationiske AMP, og viser sammenliknbare resultater til mer arbeidsintensive metoder som overflateplasmonresonans. <p>Både standard NMR teknikker og anisotropiske NMR prosedyrer ble brukt for å kartlegge strukturen av et nytt naturprodukt, Commafric A, og utforske konformasjonelle endringer i fem sykliske tetrapeptider med en uvanlig α,α‐disubstituert β2,2-aminosyre på bakgrunn av primærstrukturen deres, og fem sykliske heksapeptider i gradvis mer lipofile miljøer. Selv med sterkt varierende antimikrobielle effekter, viste det seg at konformasjonen av ryggraden ikke endret seg mye mellom de ulike peptidene, noe som indikerer at antimikrobiell effekt primært er avhengig av komposisjonen av aminosyrer, heller enn peptidenes konformasjon.