Rekombinant produksjon og protease-avhengig in vitro modning av det antimikrobielle peptidet Centrocin

Abstract

Hensikten med denne oppgaven var å lage og evaluere et system for å isolere og identifisere proteaser som er involvert i å modne marine antimikrobielle peptider (AMPer). Bioaktive substanser fra marine organismer er lovende for utvikling av terapeutiske midler. Siden marine organismer lever tett på mengder av patogene mikroorganismer, har de utviklet et robust og effektivt immunsystem, der iblant AMPer. Mange AMPer er avledet fra inaktive forløper molekyler, og blir prosessert av proteaser for å frigjøre den aktive formen. Proteaser er viktige molekylære verktøy innenfor ulike industrier og bioteknologi, og marine proteaser har flere egenskaper som er ønskelige for ulike anvendelser, slik som aktivitet ved lav temperatur. Den metodiske tilnærmingen i denne oppgaven bestod av å konstruere og produsere en proteinkonstruksjon med innhold av et marint AMP og andre utvalgte domener, for å kunne benytte denne som et agn for protease(r). Domenene i konstruktet bestod av fluorescerende proteiner, affinitetstagger, AMPet og kommersielle protease-kløyvesteder. Proteinanalyser gav resultater som bekreftet rekombinant produksjon av proteinkonstruksjonen. Videre ble det rekombinante proteinet renset ved å bruke affinitetsrensing, og det ble da avdekket at noe av proteinet trolig var degradert til mindre proteinfragmenter. For å undersøke om proteinet kunne kløyves ved de inkluderte kløyvesteder i proteinet, ble kommersiell protease benyttet og resultatet viste at proteinet trolig ble kløyvd ved ett eller ved flere av kløyvestedene, og dette resultatet gav grunnlag for å utføre forsøk av krysslinking av mål-protein med den kommersielle proteasen. Det ble et interessant resultat av krysslinkingen, og det viste at et kompleks av protease og protein trolig var forekommet, men ikke med det fullstendige mål-proteinet, men sannsynligvis med en fragmentert del av proteinet. Dette viste likevel at det var mulig å oppnå pulldown, det å fange et protein-protease kompleks.